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藍舌病病毒（BTV）熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書
【產品名稱】
商品名稱：藍舌病病毒（BTV）核酸檢測試劑盒(RT-PCR 熒光探針法)
Name ：Diagnostic Kit for Bluetongue Virus RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)
【包裝規格】48 份/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于檢測的動物脾、淋巴結、肝、腎組織；精液樣品。等標本中藍
舌病病毒 RNA，適用于藍舌病病毒感染的輔助診斷。其檢測結果僅供參考。
【檢驗原理】
本試劑盒用一對藍舌病病毒特異性引物，結合一條特異性熒光探針，用一步法
熒光 RT-PCR 技術對藍舌病病毒 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染
者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 規 格
酶液 50μl×1 管
BTV 反應液 1.0ml×1 管
BTV 陽性質控品 50μl ×1 管
陰性質控品 250μl ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 5 次，
有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ
Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
動物脾、淋巴結、肝、腎組織；精液樣品。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標
本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.05g 于
研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管
中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100uL 于 1.5mL 滅菌離心管中；排泄物：取 0.05g
于 1.5mL 滅菌離心管中，加入 1mL 生理鹽水渦旋振蕩，8000rpm 離心 2min，取上
清液 100uL 于 1.5mL 滅菌離心管中；精液樣品直接取 100uL 于 1.5mL 滅菌離心管
中。
1.2RNA 提取
推薦采用上海烜雅生物科技有限公司生產的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取
法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性
對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
0612委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)核酸檢測試劑盒(RT-PCR法)
0512馬傳染性貧血病病毒(EIAV)核酸檢測試劑盒(RT-PCR法)
0412馬動脈炎病毒(EAV)核酸檢測試劑盒(RT-PCR法)
0312西部馬腦炎病毒(WEE)核酸檢測試劑盒(RT-PCR法)
0212東部馬腦炎病毒(EEE)核酸檢測試劑盒(RT-PCR法)
試劑 BTV 反應液 酶液
用量 20μl 1μl
3. 加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μl，分別加入相應的反
應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25ul；熒光通道選擇：
檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿
選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環參數設置：
步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle
94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5. 結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲
線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15
范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value
值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線；
可疑：檢測通道 35.0<Ct 值≤37，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35.0<Ct
值≤37，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測結果 Ct 值>37 或無 Ct 值。
6. 檢測方法的局限性
Ø 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
Ø 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
Ø 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或
定量檢測不準確的結果；
Ø 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
Ø 所有操作嚴格按照說明書進行；
Ø 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；
Ø 反應液應避光保存；
Ø 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區工作服；
Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
Ø 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全
通則》進行處理。
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