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口蹄疫病毒亞洲1型FMDV-Asia1熒光PCR試劑盒說明書
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：口蹄疫病毒亞洲 1 型（FMDV-Asia1）核酸檢測試劑盒(RT-PCR 熒光探針法)
Name ：Diagnostic Kit for Foot-and-mouth Disease Virus Type Asia I RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)
【包裝規(guī)格】48 份/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于檢測的水泡皮及水泡液、O/P液等標本中口蹄疫病毒亞洲1型RNA，適用于口蹄疫病毒亞洲1型感染的輔助診斷。其檢測結(jié)果僅供參考。
【檢驗原理】
本試劑盒用一對口蹄疫病毒亞洲1型特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，
用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對口蹄疫病毒亞洲1型RNA進行體外擴增檢測，用于
臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱 規(guī) 格
酶液 50μl×1 管
FMDV-Asia1 反應(yīng)液 1.0ml×1 管
FMDV-Asia1 陽性質(zhì)控品 50μl ×1 管
陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融少于 5 次，
有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ
Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺動物，取水泡皮及水泡液；待檢活動物，取 O/P 液 2~3mL。
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標
本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
水泡皮樣品：稱取水泡皮 0.05g 于研磨器中研磨，加入生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻
漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100uL 于 1.5mL 滅
菌離心管中；OP 液或水泡液樣品，直接取 100uL 置于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取
法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性
對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 FMDV-Asia1 反應(yīng)液 酶液
用量 20μl 1μl
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl，分別加入相應(yīng)的反
應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul；熒光通道選擇：
檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿
選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle
94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5. 結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲
線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15
范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value
值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。
6. 檢測方法的局限性
樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；
病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或
定量檢測不準確的結(jié)果；
本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
所有操作嚴格按照說明書進行；
試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；
反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；
樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全
通則》進行處理。
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