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口蹄疫病毒O型FMDV-O熒光PCR核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：口蹄疫病毒 O 型（FMDV-O）核酸檢測(cè)試劑盒(RT-PCR 熒光探針?lè)?
Name ：Diagnostic Kit for Foot-and-mouth Disease Virus Type O RNA(RT-PCR Fluorescence Probing)
【包裝規(guī)格】48 份/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于檢測(cè)的水泡皮及水泡液、O/P液等標(biāo)本中口蹄疫病毒 O 型 RNA，
適用于口蹄疫病毒 O 型感染的輔助診斷。其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒用一對(duì)口蹄疫病毒 O 型特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用一
步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)口蹄疫病毒 O 型 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)
可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱 規(guī) 格
酶液 50μl×1 管
FMDV-O 反應(yīng)液 1.0ml×1 管
FMDV-O 陽(yáng)性質(zhì)控品 50μl ×1 管
陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管
說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 5 次，
有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ
Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺動(dòng)物，取水泡皮及水泡液；待檢活動(dòng)物，取 O/P 液 2~3mL。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)
本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
水泡皮樣品：稱取水泡皮 0.05g 于研磨器中研磨，加入生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻
漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100uL 于 1.5mL 滅
菌離心管中；OP 液或水泡液樣品，直接取 100uL 置于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取
法），請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性
對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 FMDV-O 反應(yīng)液 酶液
用量 20μl 1μl
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl，分別加入相應(yīng)的反
應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul；熒光通道選擇：
檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請(qǐng)勿
選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle
94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5. 結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲
線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15
范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value
值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。
試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；
反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；
樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；
試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全
通則》進(jìn)行處理。
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