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結核桿菌(TB)熒光PCR核酸擴增檢測試劑盒說明書
【產品名稱】
通用名稱：結核桿菌(TB)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
Name ：Tubercle Bacillus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
4.1結核病是由結核桿菌（Tubercle bacillus， TB）引起的傳染性疾病，可累及全身多個器官，但以肺結核為常見。據世界衛生組織報道，*有超過三分之一的人口被致病菌結核分枝桿菌所感染，其中約10%的人們在其有生之間將面臨活動性結核病的困擾[1]。而在這些結核病患者中，每年有200萬人喪生。雖然有抗菌藥物，但其療程至少要6個月，且花費巨大，由于經濟等原因而常常使患者無以為繼[2]。本試劑盒適用于檢測人氣管分泌物拭子、肺組織等樣本中的結核桿菌，用于結核桿菌感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術，設計一對結核桿菌特異性引物，結合一條特異性探針，用熒光PCR技術對結核桿菌的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 規 格
核酸提取液 1.5mL×2管
酶液 50μL×1管
TB反應液 1.0mL×1管
TB陽性質控品 50μL×1管
陰性質控品 250μL×1管
注：
1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過5次，有效期12個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】
無菌采集人肺病變部位或病變/非病變部位交界處的樣品；或用滅菌棉拭子沾取人氣管分泌物，放入無菌試管中。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；氣管分泌物取100μL提取。
1.2DNA提取
1)對上述處理好的標本加入等體積核酸提取液（固體標本加入50μL核酸提取液），100℃恒溫處理10min，13,000 rpm離心5min，取上清液轉移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；
2)DNA的提取也可以采用上海晅科生物科技股份有限公司生產的DNA提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 TB反應液 酶液
用量（樣本數為N） 20μL 1μL
將混合好的測試反應液分裝到PCR反應管中，21uL/管。
3.加樣（樣本處理區）
將步驟1提取的DNA、陽性質控品、陰性質控品各取4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR擴增（核酸擴增區）
4.2將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內；
4.3設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。
4.4推薦循環參數設置：
步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號
1 1 cycle 95℃ 10min 否
2 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop值(一般可在5~20范圍內調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且明顯的擴增曲線。
可疑：檢測通道Ct值>35.0，且出現明顯曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果如果同樣出現Ct值≤35.0和明顯擴增曲線則為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。
6. 檢測方法的局限性
1）樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
2）樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
3）陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
4）病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
5）不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
6）試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
7）本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7.質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線或無Ct值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且Ct值≤32；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
【注意事項】
1.所有操作嚴格按照說明書進行；
2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；
3.反應液應避光保存；
4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
Ø[1] Anon, W. H. O. (2006). Global Tuberculosis Control, Surveillance, Planning, Financing. Geneva: WHO, 1-242.
Ø[2] Russell, D. G. (2007). Who puts the tubercle in tuberculosis? Nat Rev Microbiol 5, 39-47.
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