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霍亂弧菌O1(VC O1)熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書
【產品名稱】
通用名稱：霍亂弧菌O1(VC O1)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
Name ：Vibrio cholerae O1 (VC O1) nucleic acid detection kit (fluorescence-PCR method)
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
霍亂弧菌O1(VC O1)是腸桿菌科中一大類重要的致病菌，感染畜禽后可引起一系列的疾病，成為畜禽肉胴體、畜禽產品污染的重要來源，并可以通過各種途徑傳染給人，引起人的食源性疾病[1]。為有效地預防和控制疾病發生，建立快速、敏感而又特異的檢測方法，PCR技術已成為檢測食品、臨床樣品和環境樣品中霍亂弧菌O1的重要手段[2,3]。
本試劑盒適用于檢測水樣糞便，疑似污染的水、食物等樣本中的霍亂弧菌O1，用于霍亂弧菌O1感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術，設計一對霍亂弧菌O1特異性引物，結合一條特異性探針，用熒光PCR技術對霍亂弧菌O1的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
注：
1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過5次，有效期12個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】
水樣便取0.5~1mL；疑似污染的食物取1g
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
水樣便13000rpm離心2min，去盡上清；疑似污染的食物用手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；疑似污染的水直接取100μL
1.2DNA提取
1)對上述處理好的標本加入50μL核酸提取液，100℃恒溫處理10min，13,000 rpm離心5min，取上清液轉移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；
2)DNA的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產的DNA提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：
將混合好的測試反應液分裝到PCR反應管中，21uL/管。
3.加樣（樣本處理區）
將步驟1提取的DNA、陽性質控品、陰性質控品各取4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop值(一般可在5~20范圍內調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。
可疑：檢測通道Ct值>35.0，且出現典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現Ct值≤35.0和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。
7.質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線或無Ct值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且Ct值≤32；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
【參考文獻】
[1] 曾曉芳. 畜產品中霍亂弧菌O1?污染的檢測與控制[J]. 四川畜牧獸醫, 2003, 30(4):28-29.
[2] Marijia T, Gorazd A, An improved 16S rRNA based PCR method for the specific detection of Salmonella enteria [J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 80: 67-75.
[3] Judy S W, Karen L J, Suresh D P, et al. Specific detection of Salmonella spp. By multiplex polymerase chain reaction [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(5): 1473-1479.
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