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豬瘟/藍耳CSFV/PRRSV-HP熒光PCR檢測試劑盒說明書
【產品名稱】
通用名稱：豬瘟/高致病性豬藍耳病病毒(CSFV/PRRSV-HP)?核酸檢測試劑盒(實時熒光-PCR法)
Name ：Nucleic acid detection kit for swine fever / highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (CSFV/PRRSV-HP) (real-time fluorescent -PCR)
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
豬瘟/高致病性豬藍耳病病毒(CSFV/PRRSV-HP)?感染引起的豬急性、熱性、高度接觸性傳染病。其特征為高熱，網狀內皮系統出血，死亡率高。家養豬和野豬都可以被感染，而且不分品種和年齡。
本試劑盒適用于檢測分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結等樣本中的豬瘟/高致病性豬藍耳病病毒(CSFV/PRRSV-HP)?，用于豬瘟/高致病性豬藍耳病病毒(CSFV/PRRSV-HP)?感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒根據豬瘟/高致病性豬藍耳病病毒(CSFV/PRRSV-HP)??基因組設計特異性引物和探針，用熒光 PCR 技術對核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 規 格
核酸提取液 1.5mL×2 管
酶液 50μL×1 管
ASFV 反應液 1.0mL×1 管
ASFV 陽性質控品 50μL×1 管
陰性質控品 250μL×1 管
注：
1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 7 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺豬，取分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結等
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取
0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；全血樣本：待血凝固后，取血清 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2DNA 提取
1)對上述處理好的標本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000
rpm 離心 5min，取上清液轉移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；
2)DNA 的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產的 DNA 提取試劑盒
（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 ASFV 反應液 酶液
用量（樣本數為 N） 20μL 1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3.加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）
NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環參數設置：
步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號
1 1 cycle 95℃ 10min 否
2 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。
可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現 Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。
6.檢測方法的局限性
樣本檢測結果不樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7.質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
【注意事項】
所有操作嚴格按照說明書進行；
試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻幵短暫離心；
反應液應避光保存；
反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
使用一次性吸頭、一次性手套和各區與用工作服；
樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
試劑盒里所有物品應視為污染物對待，幵按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]國家質量監督檢驗檢疫總局. SN/T 1559-2010 非洲豬瘟檢疫技術規范[S].
[2]黃萍, 肖家勇, 歐陽振宇. 非洲豬瘟病毒實時熒光定量 PCR 檢測方法的建立[S]. 中國動物檢疫, 2010.
[3]董志珍, 侯艷梅, 趙祥平. 非洲豬瘟病毒實時熒光定量 PCR 檢測方法的建立[S]. 中國獸醫雜志, 2009.
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