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豬瘟藍耳口蹄疫CSFV/PRRSV-U/FMDV-U熒光PCR說明書
【產品名稱】
商品名稱：豬瘟病毒/豬藍耳病病毒通用型/口蹄疫病毒通用型(CSFV/PRRSV-U/FMDV-U)核酸檢測試劑盒(實時熒光-PCR 法)
Name ：Classical swine fever virus / swine ear disease virus universal / foot-and-mouth disease virus universal (CSFV/PRRSV-U/FMDV-U) nucleic acid detection kit (real-time fluorescence -PCR)
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
口蹄疫病毒（FMDV）屬小 RNA 病毒科屬，是小的動物病毒之一，在世界范圍廣泛分布，其中，O、A、C 型 FMDV 的毒力和抗原性均易發生變易，幾乎遍布亞、非、拉、歐各洲；AsiaⅠ型主要分布在亞洲；SATI、SAT2、SAT3 型主要分布在非洲[1-2]。口蹄疫病毒血清型復雜多變，為檢測帶來了較大的難度[3]。
本試劑盒適用于檢測口蹄疫易感動物的水泡皮及水泡液、O/P 液等標本中口蹄疫病毒通用型 RNA，適用于口蹄疫病毒通用型感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒對口蹄疫病毒通用型特異核酸序列設計引物和探針，用一步法熒光RT-PCR 技術對口蹄疫病毒通用型 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 規 格
酶液 50μL×1 管
FMDV-U 反應液 1.0mL×1 管
FMDV-U 陽性質控品 50μL ×1 管
陰性質控品 250μL ×1 管
注：
1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺動物，取水泡皮及水泡液；待檢活動物，取 O/P 液 2~3mL。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
水泡皮樣品：稱取水泡皮 0.5g 于研磨器中研磨，加入生理鹽水繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；OP 液或水泡液樣品，直接取 100μL 置于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 FMDV-U 反應液 酶液
用量 20μL 1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3.加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道
（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環參數設置：
步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號
1 1 cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、
stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
6.質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線丏無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，丏 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
【參考文獻】
[1]Mulle JD，McEachern JA，Bossart KN，et al. Serotype-independent detection of foot-and-mouth disease virus [J]. J Virol Methods [J].2008，151（1）：146-153.
[2]吳紹強.亞歐型及南非型口蹄疫一步法多重熒光 RT-PCR 檢測方法建立[J]. 中國農業科學，2010，43（14）：3019-3026.
[3]Mason PW，Grubman MJ，Baxt B. Molecular basis of pathogenesis of FMDV [J].Virus Res，2003，91（1）：9-32.
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