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禽流感病毒H9N6(AIV-H9N6)熒光PCR試劑盒說明書
【產品名稱】
商品名稱：禽流感病毒H9N6（AIV-H9N6）核酸檢測試劑盒（實時熒光-PCR 法）
英 文 名 ：Avian influenza virus H9N6 (AIV-H9N6) nucleic acid detection kit (real-time fluorescence-PCR)
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
禽類的病毒性流行性感冒，是由A型流感病毒引起禽類的一種從呼吸系統到嚴重全身敗血癥等多種癥狀的傳染病[1]。其中禽流感病毒H9亞型，不僅可以感染禽類，也可以感染人類，特別是1999年以來，H9N2亞型AIV感染人事件的多次發生[2-3]嚴重威脅了人類健康、畜牧業生產和畜產品的貿易，其公共衛生意義已引起*的廣泛關注[4]。本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性、定量檢測禽流感病毒H9亞型，對禽流感病毒H9亞型引起的流感診斷有重要指導意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對禽流感病毒H9亞型HA基因高度保守區域設計特異性引物和探針， 在反應體系中含禽流感病毒H9亞型基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測 結果的定性、定量分析。
【試劑組成】
名 稱 規 格
酶液 50μL×1 管
AIV-H9 反應液 1.0mL×1 管
AIV-H9 陽性質控品 50μL ×1 管
陰性質控品 250μL ×1 管
注：
1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，
8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100
μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 AIV-H9 反應液 酶液
用量 20μL 1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3.加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye） FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）
NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環參數設置：
步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號
1 1 cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、
stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，丏明顯的擴增曲線。
可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，丏出現明顯曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果如果同樣出現 Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線則為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無 Ct 值丏無明顯的擴增曲線。
6.質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線丏無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，丏 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
7.檢測方法的局限性
Ø樣本檢測結果不樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
Ø樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
Ø陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
Ø病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
Ø不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
Ø試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
【注意事項】
Ø所有操作嚴格按照說明書進行；
Ø試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；
Ø反應液應避光保存；
Ø反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
Ø使用一次性吸頭、一次性手套和各區與用工作服；
Ø樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
Ø實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
Ø試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1]WEBSTER R G, BEAN W J, GORMA N O T, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses [J] . Microbiol Rev, 1992, 56(1): 152 -179.
[2]GUO Y J, KRAUSS S, SENNE D A, et al. Characterization of the pathogenicity of members of the newly established H9N2 influenza virus lineages in Asia
[J] .Virology, 2000, 267( 2):279 -288.
[3]唐秀英, 付朝陽, 馮菊艷. H9 亞型禽流感的流行不防制[J] . 預防獸醫學進展, 2000, 2( 4): 1-3.
[4]郭元吉, 李建國, 程小雯, 等. 禽 H9N2 亞型流感病毒能感染人的發現[J] . 中華實驗和臨床病毒學雜志, 1999, 13( 2): 105-108.
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