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甲型流感H1N1亞型IAV-H1N1熒光PCR試劑盒說明書
【產品名稱】
商品名稱：甲型流感病毒 H1N1 (IAV-H1N1) 核酸檢測試劑盒 (熒光-PCR 法)
Name ：Influenza A virus subtype H1N1 Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
甲型流感H1N1是一種RNA病毒，屬于正黏液病毒科。它的宿主是犬科動物、鳥類和一些哺乳動物。幾乎所有甲型的 H1N1 病毒已被隔離，野生鳥類出現疾病屬罕見。有些 H1N1 病毒引起嚴重的疾病大多發生于家禽和寵物方面，而人類卻很少出現。但經過鳥類和犬科動物為主的哺乳動物的傳播和變異，這可能導致疫情或人類流感大面積傳播。
本試劑盒適用于檢測鼻咽拭子、氣管分泌物等標本中的甲型流感病毒 H1N1RNA，適用于甲型流感病毒 H1N1 型感染的輔助診斷及流行病學調查。
【檢驗原理】
本試劑盒根據甲型流感病毒 H1 型 HA 基因、N1 型的 NA 基因分別設計的特異性引物和熒光探針[1-3]，用一步法熒光 RT-PCR 技術對甲型流感病毒 H1N1 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
注：
1）不同批號試劑不能混用。
2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過5次，有效期9個月。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】
患病動物：鼻咽咽拭子、氣管分泌物；血液：用一次性無菌注射器抽取靜脈血
2mL。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標
本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
鼻咽棉拭、氣管分泌物取 100μl。血液樣品，3000rpm 離心 5min，吸取 100μL 上層血清，轉移至 1.5mL 滅菌離心管
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3. 加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM、ROX， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，
請勿選擇 ROX 參比熒光。
4.3 推薦循環參數設置：
5. 結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
FAM 通道為甲型流感病毒 H1N1 中 H1 基因檢測結果，ROX 通道為甲型流感病毒 H1N1 中 N1 基因檢測結果
陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。
可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復
試驗結果出現 Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。
6. 檢測方法的局限性
Ø 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
Ø 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
Ø 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或
定量檢測不準確的結果；
Ø 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
【注意事項】
Ø 所有操作嚴格按照說明書進行；
Ø 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；
Ø 反應液應避光保存；
Ø 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區工作服；
Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
Ø 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全
通則》進行處理。
【參考文獻】
[1] 陳棋炯, 孫永祥, 丁軍, 等. 應用實時熒光定量 PCR 技術快速檢測甲型
H1N1 流感病毒[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2010.
[2] 吉林省質量監督局. DB22∕T 2563-2016 甲型 H1N1 流感病毒核酸檢測
Real-timePCR 法[S].
[3] 侯義宏, 王慧煜, 梅琳. 甲型 H1N1 流感病毒一步法多重 RT-PCR 檢測方法的
建立[J]. 動物檢疫學分會 2010 年學術年會論文集, 2010.
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