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禽流感病毒H5N1亞型(AIV-H5N1熒光PCR試劑盒說明書
【產品名稱】
商品名稱：禽流感病毒 H5N1 亞型（AIV- H5N1）核酸檢測試劑盒(實時熒光-PCR 法)
Name ：Diagnostic Kit for Avian Influenza Virus subtype H5N1 RNA (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于檢測標本中的禽流感病毒 H5N1 亞型 RNA，適用于禽流感病毒 H5N1 亞型感染的輔助診斷及流行病學調查，其檢測結果僅供參考。
【檢驗原理】
本試劑盒用禽流感病毒 H5N1 亞型的特異性引物，分別結合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術對禽流感病毒 H5N1 亞型 RNA 進行體外擴增檢測， 用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 規 格
酶液 50μL×1 管
AIV-H5N1 反應液 1.0mL×1 管
AIV-H5N1 陽性質控品 50μL ×1 管
陰性質控品 250μL ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 7 次，有效期 9 個月。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96、Roche Gene 6000、Roche LC480 等熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子 取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.05g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 AIV-H5N1 反應液 酶液
用量 20μL 1μL
3.加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道
（Reporter Dye）FAM、ROX， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇NONE，
請勿選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環參數設置：
步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
FAM 通道為禽流感病毒 H5 亞型檢測結果，ROX 通道為禽流感病毒 N1 亞型檢測結果
陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。
可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現 Ct 值≤35.0 和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。
6.檢測方法的局限性
樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7.質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
【注意事項】
所有操作嚴格按照說明書進行；
試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；
反應液應避光保存；
反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
使用一次性吸頭、一次性手套和各區工作服；
樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全 通則》進行處理。
公司優勢：
1）質量：我司提供的的試劑為世界
2）價格：價格實惠，量大從優。
4）服務：提供完整的售前、售后和售中服務。售后到底
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