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禽流感病毒H5N6亞型(AIV-H5N6熒光PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)
【產(chǎn)品名稱(chēng)】
商品名稱(chēng)：禽流感病毒 H5N6 亞型（AIV- H5N6）核酸檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光-PCR法)
Name ：Diagnostic Kit for Avian Influenza Virus subtype H5N6 RNA (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】48T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于檢測(cè)標(biāo)本中的禽流感病毒 H5N6 亞型 RNA，適用于禽流感病毒 H5N6 亞型感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查，其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒用禽流感病毒 H5N6 亞型的特異性引物，分別結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)禽流感病毒 H5N6 亞型 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)， 用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱(chēng) 規(guī) 格
酶液 50μL×1 管
AIV-H5N6 反應(yīng)液 1.0mL×1 管
AIV-H5N6 陽(yáng)性質(zhì)控品 50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管
說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 7 次，有效期 9 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96、Roche Gene 6000、Roche LC480 等熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子 取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱(chēng)取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 AIV-H5N6 反應(yīng)液 酶液
用量 20μL 1μL
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測(cè)通道
（Reporter Dye）FAM、ROX， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇NONE，
請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
FAM 通道為禽流感病毒 H5 亞型檢測(cè)結(jié)果，ROX 通道為禽流感病毒 N1 亞型檢測(cè)結(jié)果
陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線。
可疑：檢測(cè)通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和典型擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果無(wú) Ct 值且無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線。
6.檢測(cè)方法的局限性
樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；
陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；
病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；
本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
7.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無(wú)明顯擴(kuò)增曲線且無(wú) Ct 值顯示；
陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
【注意事項(xiàng)】
所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；
試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；
反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；
樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；
試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全 通則》進(jìn)行處理。
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